Genetyka - Kontrola jakości genetycznej szczepów wsobnych oraz pokolenia F1 mieszańców szczepów wsobnych gryzoni laboratoryjnych

Szczepy wsobne o zdefiniowanym profilu genetycznym oraz pokolenie F1 mieszańców szczepów wsobnych to popularne modele zwierzęce z wyboru w badaniach in vivo. Ze względu na unikatowy i stabilny fenotyp prezentują pożądane, tj. podobne i przewidywalne reakcje eksperymentalne. Gwarancją wymienionych cech jest homozygotyczność, będąca efektem kojarzenia w bliskim pokrewieństwie (brat z siostrą) oraz izogeniczność, czyli zasadniczo identyczny profil genetyczny przedstawicieli tego samego szczepu wsobnego lub wspomnianego pokolenia F1. Utrata homozygotyczności i izogeniczności w obrębie szczepu skutkuje powstaniem tzw. podszczepu bądź podlinii. Dzieje się tak najczęściej na skutek kontaminacji genetycznej - czyli niezamierzonego skojarzenia osobników różnych szczepów albo utrzymującej się, resztkowej heterozygotyczności bądź mutacji, których efekty kumulują się gdy szczep jest podzielony  na subpopulacje. Wdrożony w Charles River program zapewniania jakości genetycznej szczepów wsobnych obejmuje: stosowanie szczegółowych procedur zarządzania hodowlą w celu zapobiegania, ograniczania i wykrywania zróżnicowania w obrębie szczepu (1); oraz rutynowy monitoring genetyczny prowadzony w celu wykluczenia kontaminacji genetycznej (2).

I. Zarządzanie hodowlą szczepów wsobnych

Do najważniejszych elementów zarządzania hodowlą szczepów wsobnych należy prowadzenie kojarzeń wg schematu określanego mianem „piramidy systemu kojarzeń“ oraz szczegółowa dokumentacja hodowlana. Szczyt „piramidy“, czyli jądro zarodowe to grupa par rodzicielskich kojarzonych w bliskim pokrewieństwie (brat z siostrą). Dla każdej z par prowadzona jest osobna dokumentacja hodowlana. Utrzymywane w izolatorach w Wilmington (MA) jądra zarodowe stanowią źródło par rozpłodowych dla hodowli zarodowych utrzymywanych w pomieszczeniach hodowlanych za barierą sanitarną. Tu również prowadzi się kojarzenie w bliskim pokrewieństwie (brat z siostrą) odnotowywane w dokumentacji hodowlanej. Raz na trzy do pięciu lat (w ciągu 10 pokoleń), w celu zarządzania dryfem genetycznym, do każdej z hodowli zarodowych, utrzymywanych za barierą sanitarną wprowadza się zwierzęta rozpłodowe z jąder zarodowych. Z kolei, hodowle zarodowe stanowią źródło rozpłodników - opcjonalnie - dla populacji hodowlanej (jeśli jest prowadzona) lub bezpośrednio dla hodowli produkcyjnej. Chów w obrębie populacji hodowlanej odbywa się w oparciu o kojarzenie rodzeństwa, z tym, że nie wyprowadza się już i nie dokumentuje drzew rodowodowych. Jądra zarodowe wraz hodowlami zarodowymi są źródłem wszystkich zwierząt rozpłodowych dla każdej indywidualnej hodowli produkcyjnej. Hodowle produkcyjne prowadzone są w oparciu o kojarzenie losowe. Ważną cechą schematu jest zasada, że wszystkie zwierzęta rozpłodowe są potomstwem par rodzicielskich, kojarzonych w bliskim pokrewieństwie (brat z siostrą). Taki sposób postępowania zwiększa prawdopodobieństwo ekspresji nowych alleli recesywnych (pochodzących m.in. z niezamierzonego kojarzenia) w fenotypie potomstwa - np. w postaci nowego koloru umaszczenia: brązowego albino lub agouti. Dokumentacja hodowlana oraz obserwacja stada prowadzona przez personel techniczny to działania kluczowe dla skutecznego wychwytywania kontaminacji genetycznych. Na przykład wzrost liczebności osobników w miocie może wskazywać na heterozję (tzw. wigor lub bujność mieszańców), charakterystyczną dla kontaminacji genetycznej, podobnie jest ze zmianą koloru okrywy włosowej u potomstwa.

II. Monitoring genetyczny szczepów wsobnych

A. Wprowadzenie

Ze względu na częsty brak jednoznacznych śladów kontaminacji w obrębie szczepów wsobnych lub pokolenia F1 mieszańców szczepów wsobnych, jakościowa analiza markerów genetycznych jest działaniem niezbędnym dla potwierdzania standardu genetycznego prowadzonej hodowli. Rozwój technik analitycznych z zakresu genetyki molekularnej umożliwił zastąpienie diagnostyki biochemicznej i immunologicznej badaniem polimorfizmu DNA - początkowo bazującym na analizie zmienności w liczbie powtórzeń tandemowych w mini i mikrosaltelitarnym DNA, a obecnie opartym na badaniu polimorfizmów jednonukleotydowych (SNPs), zaprojektowanym w sposób umożliwiający analizę dużej ilości loci rozmieszczonych w obrębie całego genomu. Wykorzystywane w monitoringu genetycznym markery jakościowe, dobierane są w sposób umożliwiający zarówno analizę całego genomu danego gatunku, jak również różnicowanie popularnych modeli badawczych - zwłaszcza tych utrzymywanych w bliskim sąsiedztwie, stwarzającym potencjalne zagrożenie kontaminacją genetyczną. Opracowane dla potrzeb monitoringu genetycznego profile alleli, porównuje się ze standardem ustalonym dla danego szczepu. Odchylenie od przyjętego standardu, potwierdzając kontaminację, może być również wskazówką co do źródła lub źródeł „skażenia”.

B. Program monitoringu genetycznego w Charles River

Monitoring genetyczny myszy i szczurów hodowanych w Charles River prowadzony jest w oparciu o testy analizujące po 32 loci SNP zlokalizowane w chromosomach autosomalnych oraz w chromosomie X. SNP w każdym z paneli zostały dobrane w taki sposób by różnicować szczepy, a nie podszczepy – co zwiększa prawdopodobieństwo ujawnienia  kontaminacji, zamiast efektów dryfu genetycznego. Genotypowanie SNP wykonywane jest na mikromacierzy w oparciu o amplifikację badanej próbki metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy) z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych (TaqMan® OpenArray®, Thermo Fisher). Każdy SNP jest dymorficzny, tj. ma dwa allele. Obydwa allele identyfikowane są za pomocą komplementarnych, oligonukleotydowych sond fluorescencyjnych. Sonda dla jednego z nich oznakowana jest znacznikiem FAM, dla drugiego - znacznikiem VIC. W związku z tym, analizowane sekwencje raportowane są jako FF lub VV – w przypadku homozygot oraz FV – dla heterozygot. Zamieszczona tabela wyselekcjonowanych profili alleli potwierdza spodziewaną homozygotyczność szczepów wsobnych lub heterozygotyczność mieszańców pokolenia F1 (ze względu na zróżnicowane genotypy rodzicielskie) w każdym markerze SNP.