Dlaczego należy brać pod uwagę płeć zwierząt jako zmienną biologiczną w badaniach przedklinicznych?

W badaniach biomedycznych zajmujących się odkrywaniem nowych leków na choroby ludzkie, jedna płeć myszy jest dużo częściej wykorzystywana (wręcz nieproporcjonalnie częściej) niż druga – czasami z uzasadnionych powodów naukowych, a często również nie. Pominięcie jednej płci w testach może znacznie zmienić wyniki badań, a także doprowadzić do błędnych wniosków końcowych. Poza naukowymi powodami wyboru płci zwierząt, należy również wziąć pod uwagę aspekty etyczne oraz zasadę tzw. 3R (z ang. Replacement, Reduction, Refinement).

Dlaczego samice myszy mogą być preferowane do badań?

W niektórych sytuacjach samice myszy mogą być preferowane w stosunku do samców myszy, zwłaszcza w przypadku określonych szczepów, takich jak NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) oraz C57BL/6J (B6J). W przypadku myszy NSG sugeruje się, że wszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) jest bardziej skuteczne u samic myszy-biorców niż u samców myszy-biorców (Notta i in., 2010, Gonzalez i in., 2013). Jednakże, nowsze doniesienia wykazały, że owszem lepsze wszczepienia ludzkiego HSC zaobserwowano u samic myszy NSG we wczesnych punktach czasowych, ale już odtworzenie ludzkich komórek odpornościowych zarówno w szpiku kostnym jak i w śledzionie humanizowanych myszy NSG nie wykazywało różnic u myszy w przedziale od 16 do 20 tygodnia po wszczepieniu (Borsotti i in., 2017). Naukowcy ci wykazali, że chociaż istnieją różnice w kinetyce ekspansji określonych subpopulacji komórek odpornościowych podczas progresji oraz dojrzewania, to ogólne odsetki oraz liczby komórek równoważą się u różnych gospodarzy po zakończeniu rozwoju wszystkich linii. Opracowując nowe badania przedkliniczne dotyczące skuteczności tego procesu, naukowcy powinni wziąć pod uwagę również fakt, że wykazano, iż odpowiedzi immunologiczne, a także wzrost przeszczepionego guza różnią się u samic oraz samców myszy NSG (Notta i in., 2010, Gonzalez i in., 2013, Martin-Padura i in., 2010). Dlatego też naukowcy powinni rozważyć wykorzystanie obydwóch płci myszy NSG, aby w pełni zrozumieć reakcje immunologiczne oraz odpowiedź nowotworów na nowe terapie.

W przypadku myszy wsobnych, takich jak B6J, preferencja wyboru samic myszy do badań często opiera się na założeniu, że samce są bardziej agresywne niż samice i dlatego są trudniejsze do opanowania przez techników. Ta specyficzna dla płci różnica jest również prawdziwa w przypadku wielu innych, powszechnych szczepów wsobnych, a to z kolei niestety prowadzi do pojawienia się uprzedzeń w wyborze zwierząt, co może skutkować nieoczekiwanymi wynikami w badaniach przedklinicznych. Ponadto, dowiedziono, że agresywne zachowanie samców myszy wsobnych, w tym B6J, jest skorelowane z różnymi poziomami aktywności neurochemicznej, a także z poziomem testosteronu (Miczek i wsp., 2001). Natomiast jeśli chodzi o samice myszy, to również mogą być agresywne w stosunku do siebie i swoich partnerów, ale jest to zwykle związane ze środowiskiem społecznym po porodzie. Podsumowując, możliwość mieszania grup myszy bez obaw o agresję, może być czynnikiem, który pozwoli naukowcom na osiągnięcie randomizacji w swoich badaniach. Co więcej, wykorzystywanie obydwóch płci zwierząt pozwali badaczom na wyjaśnienie wszelkich interakcji płciowych na nowe terapie lekowe.

Dlaczego samce myszy mogą być preferowane do badań?

Co ciekawe, niektóre obszary badań wykazują odwrotną tendencję niż opisaną powyżej, gdzie to właśnie samce są historycznie preferowaną grupą badawczą do eksperymentów. Jednakże nadmierne poleganie na samcach myszy w procesach opracowywania nowych leków może spowodować, że samice będą przyjmować leki w nieodpowiednich dawkach, a co więcej mogą nawet cierpieć na skutki niepożądane, które mogą nie występować u samców. Niedostateczna reprezentacja samic myszy w badaniach biomedycznych opiera się na założeniu, że wyniki u samic są z natury bardziej zmienne niż u samców, co potencjalnie komplikuje interpretację danych eksperymentalnych. Jednakże, w innych badaniach wykazano, że samice nie są wcale bardziej zmienne niż samce (Becker i in., 2016, Itoh i Arnold, 2015, Prendergast i in., 2014).

Dwadzieścia lat po wprowadzeniu na rynek leku o nazwie Ambien (Zolpidem) Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) uznała potrzebę obniżenia zalecanej dawki dla kobiet o połowę w porównaniu z dawką dla mężczyzn (Zakiniaeiz et al., 2016). Co więcej, badania wykazały, że kobiety mogą mieć większe ryzyko znacznego upośledzenia czynności wymagających czujności umysłowej. Fakt, że kobiety eliminują Zolpidem ze swoich organizmów wolniej niż mężczyźni, zostałby wykryty znacznie wcześniej, gdyby w badaniach przedklinicznych uznano płeć za istotną zmienną biologiczną, a przed badaniami klinicznymi zostałyby uwzględnione zarówno samce jak i samice. Z kolei samice i samce u myszy tego samego szczepu często różnią się manifestacją chorób, a także końcową reakcją na leczenie (Karp i in., 2017). W kilku badaniach zastosowano eksplorację danych i/lub analizę przeglądu literaturowego, a następnie ujawniono, że w około 50% publikacji naukowych nie podano ani płci ani wieku myszy. A co więcej, w 8 z 10 dyscyplin wykazało również stronniczość płciową w badaniach przedklinicznych (Beery i Zucker, 2011, Flórez-Vargas i in., 2016). Wykorzystanie obydwóch płci myszy, a także ich dokładne opisanie wraz z wiekiem jest niezwykle istotne dla zrozumienia postępu choroby oraz oceny nowych terapii, które mogą przynieść korzyści pacjentom obu płci.

Dane dotyczące stronniczości płciowej w wielu dyscyplinach biologicznych

Neuronauka

Ostatnie badania przeprowadzone wykonane przez Stephena Fergusona wykazały, że hamowanie metabotropowego receptora glutaminianu 5 (mGluR5) przywróciło normalne funkcje poznawcze, a także spowolniło akumulację amyloidu beta u myszy z chorobą Alzheimera (AD), ale jedynie u samic (Abd-Elrahman i wsp., 2020). Oczywiście brak wprowadzenia obydwóch płci do testów został uznany za jeden z czynników, które przyczyniają się do niepowodzenia odtwarzalności wyników w badaniach przedklinicznych oraz na późniejszych etapach klinicznych dotyczących opracowywania nowych leków (Collins i Tabak, 2014).

Choroby sercowo-naczyniowe

Choroby sercowo-naczyniowe rozwijają się u kobiet o 7-10 lat później niż u mężczyzn, co pozostaje główną przyczyną zachorowalności oraz śmiertelności kobiet w Stanach Zjednoczonych (Reitman, 2021). Jednakże niedostateczne rozpoznanie tej choroby, a także różnice pomiędzy płciami występujące zarówno w testach przedklinicznych jak i w badaniach klinicznych prowadzą do gorszej prewencji oraz interwencji w zaburzeniach sercowo-naczyniowych u kobiet (Towfighi i in., 2009, Flórez-Vargas i in., 2016). Kobiety i mężczyźni współdzielą większość klasycznych czynników ryzyka chorób sercowonaczyniowych takich jak: palenie tytoniu, otyłość czy nadciśnienie, ale znaczenie oraz względna waga tych czynników są różne. W kilku badaniach zbadano specyficzne dla kobiet czynniki ryzyka i zidentyfikowano przedmenopauzalną dysfunkcję hormonalną, a także chorobę nadciśnieniową w czasie ciąży jako wysoce związane czynniki z chorobą sercowo-naczyniową (Towfighi i in., 2009).

Z kolei w badaniach przedklinicznych to samce myszy są najczęściej testowane na choroby sercowo-naczyniowe. Preferencja samców w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych jest tak wysoka jak stosunek 2,25 do 1 (FlórezVargas i in., 2016). Podsumowując, badania sugerują, że zarówno diagnozy kliniczne jak i testy przedkliniczne powinny być bardziej skoncentrowane na różnicach związanych z płcią.

Autoimmunologia

Choroby autoimmunologiczne posiadają wspólną patogenezę, czyli atak immunologiczny na własne narządy organizmu. Te zaburzenia dotykają około 5-9% światowej populacji i występują częściej u kobiet. Badania wskazują, że płeć ma znaczący wpływ na rozwój chorób autoimmunologicznych, dlatego zalecają, aby naukowcy brali pod uwagę modele zawierające obydwie płci. Potencjalne mechanizmy różnic pomiędzy płciami obejmują: odmienną odpowiedź immunologiczną, proces ciąży, hormony płciowe, predyspozycje genetyczne, dziedziczenie rodzicielskie, a także czynniki epigenetyczne i środowiskowe (Ngo i wsp., 2014). Na przykład wykazano, że ciąża jest związana z remisją symptomów w mysich modelach stwardnienia rozsianego (MS) oraz eksperymentalnego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) (Langer-Gould i in., 2002). Do tych obserwacji nigdy nie doszłoby, gdyby badano jedynie samce myszy.

Inne schorzenia

Wykazano, że samce oraz samice wykazują znaczne różnice pod względem podatności na różnorodne choroby, takie jak nowotwory czy choroby zakaźne (Klein i in., 2016). Co więcej, w jednym badaniu przeprowadzonym przez International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) przeanalizowano dane fenotypowe zebrane z 10 instytucji, w tym dane dotyczące 14 000 myszy typu dzikiego oraz 40 000 myszy zmutowanych pod względem 234 cech. Wyniki pokazały, że płeć jest istotną zmienną biologiczną, która wpływa na szerokie spektrum cech, a także może służyć jako modyfikator efektu leczenia. Płeć istotnie wpływała w szczególności na około 9,9% cech jakościowych oraz 56,6% cech ilościowych. Jako modyfikator fenotypu typu knockout, płeć wpływa na końcowy efekt leczenia w 13,3% zestawów danych jakościowych oraz w 17,7% zestawów danych ilościowych (Karp i in., 2016).

Porady NC3R dotyczące redukcji ilości zwierząt wykorzystywanych w badaniach naukowych

Narodowe Centrum ustanawiające zasadę 3R (NC3R) postulujące o Zastępowaniu, Udoskonalaniu oraz Ograniczaniu liczby zwierząt użytych w badaniach, to niezależna organizacja naukowa, która została utworzona w celu wprowadzania oraz stosowania nowych technologii oraz podejść, które mają na celu minimalizowanie liczby wykorzystywanych zwierząt w badaniach, a także poprawę ich dobrostanu. NC3R udziela porad w jaki sposób wybór płci może wpłynąć na końcowy wynik projektów eksperymentalnych:

„Zarówno regulatorzy, fundatorzy jak i wydawcy publikacji naukowych zachęcają naukowców do analizy obydwóch płci zwierząt na wszystkich etapach procesów badawczych. Często błędne przekonanie, że samice myszy są z natury bardziej zmienne, jest wykorzystywane jako uzasadnienie do włączenia tylko jednej płci. Dowody empiryczne nie potwierdzają tego poglądu, a co więcej, metaanaliza porównująca wariancję obserwowaną u samców i samic myszy, gdzie myszy badano bez kontroli cyklu rujowego, wykazała, że zmienność nie była znacząco wyższa, ale występowała jedynie u samców w przypadku kilku cech.

Wykorzystanie w eksperymentach zarówno samców jak i samic zwierząt umożliwia uogólnienie wyników na całą populację, a tym samym poprawia zewnętrzną wiarygodność projektu. Różnice pomiędzy płciami dotyczą częstości występowania symptomów choroby, a także jej progresji oraz skuteczności leczenia i skutków niepożądanych. Badania przeprowadzone na gryzoniach na dużą skalę często wskazują, że płeć ma znaczące znaczenie na końcowy efekt leczenia. Naukowcy, którzy chcą badać tylko jedną płeć, muszą dokładnie uzasadnić swoją decyzję zawartą w projekcie”.

https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-designanimal-characteristics#sex-randomisation

Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) oraz Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) instruują naukowców, aby traktowali płeć zwierząt jako istotną zmienną biologiczną

Począwszy od 2014 r., NIH opracował zasady, które wymagają od wnioskodawców zgłaszania swoich planów dotyczących równowagi pomiędzy komórkami męskimi oraz żeńskimi, a także równowagi płciowej u zwierząt w badaniach przedklinicznych we wszystkich przyszłych projektach (z wyłączeniem rygorystycznie określonych wyjątków). Polityka Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dotycząca płci jako istotnej zmiennej biologicznej (Clayton i Collins, 2014) brzmi następująco:

„NIH oczekuje, że płeć jako zmienna biologiczna zostanie uwzględniona w projektach badawczych, analizach oraz raportach w badaniach przeprowadzanych na kręgowcach oraz ludziach. W przypadku wniosków proponujących analizę tylko jednej płci, należy przedstawić mocne uzasadnienie oparte o literaturę naukową oraz danych wstępnych lub innych istotnych rozważań. Zachęcamy naukowców do omówienia tych kwestii z pracownikami programu NIH przed złożeniem stosownych wniosków”.

https://orwh.od.nih.gov/sex-gender

„Należy uwzględnić zwierzęta obydwóch płci, a także uzasadnić skład płci męskiej/żeńskiej w grupach. FDA zdaje sobie sprawę, że istnieją znaczne ograniczenia podaży dotyczące wykorzystywania dorosłych zwierząt niektórych gatunków. Sponsor powinien omówić wiek oraz stan immunologiczny zwierząt wykorzystywanych w badaniach, aby jak najskuteczniej móc porównać wyniki z zamierzoną populacją ludzką. Kryteria włączenia oraz wykluczenia zwierząt do lub z testów eksperymentalnych powinny być odpowiednio określone przed rozpoczęciem projektu.”

https://www.fda.gov/emergency-preparednessand-response/mcm-regulatory-science/animal-ruleinformation

Wniosek: dlaczego naukowcy mogą oraz powinni uwzględniać płeć jako istotną zmienną biologiczną?

Samice nie są dużo bardziej zmienne niż samce. Analiza przeglądu literaturowego przeprowadzona przez grupę Beery&Zucker wykazała, że w 8 na 10 dyscyplin, zwłaszcza w neurologii (5,5 samców przypadających na 1 samicę), a także w farmakologii (5 samców przypadających na 1 samicę), badania wykazywały znaczącą stronniczość dotyczącą wyboru płci w testach przedklinicznych (Beery i Zucker, 2011). Przyczyną niepowodzenia projektu może być mylne założenie, że samice są z natury bardziej zmienne niż samce, ale niekoniecznie tak musi być. Badania przeprowadzone przez Itoh i Arnolda przeanalizowało 293 zestawy danych dotyczących ekspresji genów na mikromacierzach z wykorzystaniem ponad pięciu milionów sond. W rezultacie wykazało, że ekspresja genów żeńskich jest nieco mniej zmienna niż u samców myszy (Itoh i Arnold, 2015). Z kolei metaanaliza ekspresji 293 genów, które obejmowały samice bez określania ich stopnia zaawansowania cyklu rujowego, wykazała, że samice nie są bardziej zróżnicowane niż samce pod względem wybranych cech behawioralnych, morfologicznych, fizjologicznych oraz molekularnych (Prendergast et al., 2014).

Jeżeli płeć posiada znaczący wpływ na odpowiedź organizmu na leczenie, to analiza danych według płci pozwali naukowcom określić optymalną dawkę dla każdej z płci.

Podobnie jak w przypadku leku Zolpidem, jeśli dane są rejestrowane i analizowane według płci, to możliwe jest wykrywanie zróżnicowanych odpowiedzi dla samców i dla samic myszy.

Opłacalność, oszczędność czasu oraz wspieranie zasady 3R przy zastosowaniu  obydwóch płci do badań naukowych.

Podczas tworzenia par hodowlanych w celu wygenerowania zarówno kohort eksperymentalnych jak i kontrolnych, samice oraz samce myszy są zazwyczaj generowane w równej liczbie. Wykorzystując obydwie płcie, można zmniejszyć koszty utrzymania klatek w swoim obiekcie przez co pomieszczenia będą jeszcze lepiej dostosowane do utrzymania odpowiedniego dobrostanu zwierząt.

Rola płci w badaniach biomedycznych jest często pomijana, pomimo wskazywanych dowodów na dymorfizm płciowy w niektórych badaniach biologicznych. W praktycznie każdym badaniu fizjologicznym koncentracja na jednej płci grozi ograniczeniem wpływu leków na końcowy efekt, ponieważ wyniki mogą mieć znaczenie tylko dla połowy populacji. Większość informacji obserwowanych w medycynie pochodzi z badań biologii samców. Dr Janine Austin Clayton, zastępca dyrektora ds. badań nad zdrowiem kobiet w NIH, powiedziała w „New York Times”, że wyniki są następujące: „Posiadamy znacznie mniej informacji o każdym aspekcie biologii kobiecej w porównaniu z biologią mężczyzn”. (Jackson G, 2020, 13.11.)

Badanie zwierząt oraz komórek obydwóch płci stanowi istotny klucz do katalizowania przyszłych odkryć naukowych, a także do uzyskania głębszego poziomu zrozumienia biologii kobiecej, otwierając przy tym możliwości zróżnicowanego leczenia chorób w oparciu o odmienną płeć.

Autor: Xingtong Liu, PhD
Technical Information Scientist II
The Jackson Laboratory