Neuronauki - Komórkowe metody obrazowania przeznaczone do badań struktury oraz funkcji komórek neuronalnych

W ciągu ostatniej dekady postęp w różnorodnych technikach obrazowania oraz znakowania umożliwił podglądanie struktur i ich procesów z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową, a w tym nawet w żywych komórkach. W tym artykule przedstawiamy metody związane z mikroskopią, a także przytaczamy najnowsze wyniki badań, które pomogły naukowcom lepiej zrozumieć złożoną organizację oraz funkcję układu nerwowego u ssaków.

Fibroblast szczura otoczony równolegle ustawionymi komórkami Schwanna (SC). Komórki hodowano w 8-dołkowych mikropłytkach, µ-slide, firmy Ibidi, a następnie barwiono je następującymi markerami: S100 (kolor zielony), wimentyna (kolor szary) oraz DAPI (kolor niebieski). Obraz uzyskano za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego. Fotografia udostępniona dzięki uprzejmości: Flavia Millesi, Uniwersytet Medyczny w Wiedniu, Austria

Wizualizacja struktur oraz komponentów subkomórkowych

Znaczniki fluorescencyjne

Znakowanie fluorescencyjne jest powszechnie stosowaną i dość łatwą do wykonania metodą, która pozwala na zobrazowanie wielu struktur oraz komponentów subkomórkowych, a także ich wzajemnych interakcji  głównie w utrwalonych komórkach lub tkankach. Takie znaczniki obejmują zarówno pojedyncze cząsteczki (np. punkty kwantowe lub znakowania barwne), jak również barwniki organiczne (np. Rodamina lub Alexa), a także przeciwciała znakowane fluorescencyjnie. Dla przykładu Bhat i współpracownicy zobrazowali strukturę neuronalnych komórek CAD (z ang. cath.a-differentiated) za pomocą barwników rodaminy-falloidyny, co pozwoliło na wykrycie i ilościowe oznaczenie nanorurek (tuneli) łączących poszczególne komórki (TNT)¹.

W celu jednoczesnej wizualizacji oraz charakteryzowania wielu składników komórkowych w tej samej próbce biologicznej, często stosuje się metodę immunoznakowania z wykorzystaniem różnorodnych przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych. Na przykład Millesi i współpracownicy opracowali wielokolorowe panele barwiące poprzez ekspresję specyficznych markerów do rozróżniania: komórek Schwanna, fibroblastów oraz neuronów zwoju korzenia grzbietowego w tej samej hodowli komórkowej². Takie immunobarwienie można również wykonać na całych tkankach (np. w immunohistologii). Z kolei w celu określenia ilości neuronów w pniu mózgu, Usseglio i współpracownicy wypreparowali mózgi z dorosłych myszy, następnie utrwalili je kriogenicznie i na koniec pocięli je na skrawki tuż przed immunobarwieniem³.

Przeczytaj więcej na temat immunofluorescencji tutaj (English).

Endogeniczne znakowanie żywych komórek

W szczególności w przypadku eksperymentów dotyczących obrazowania żywych komórek wymagane jest specjalne podejście do znakowania, które nie będzie wpływać na żywotność oraz funkcję  komórek. W tym przypadku można zastosować tzw. drobnocząsteczkowe molekuły wiążące (z ang. small-molecule binders, np. aktyna SiR lub LifeAct), które są sprzężone z białkiem fluorescencyjnym (np. GFP lub RFP). Na przykład LifeAct barwi włókniste struktury aktyny (tzw. F-aktynę) w żywych (lub utrwalonych) komórkach oraz tkankach eukariotycznych. Co więcej, znacznik LifeAct związany z białkiem RFP został wykorzystany do wizualizacji cytoszkieletu F-aktyny do analizy cytoszkieletu dendrytycznego w żywych, pierwotnych neuronach w hipokampie⁴.

Przeczytaj więcej na temat wizualizacji aktyny w żywych komórkach tutaj (English).

Obrazowanie neuronowych kultur komórkowych 3D

Podczas imitowania złożonego mikrośrodowiska żywej tkanki, niezbędne jest zbadanie poszczególnych komórek tworzących wraz z innymi komórkami całościową macierz danej tkanki. Dlatego też generowanie modeli kultur komórkowych 3D wzrastających na fizjologicznym rusztowaniu jest niezmiernie istotną strategią do zrozumienia wewnętrznej struktury oraz funkcji komórki.
Aby móc zbadać interakcję ludzkich obwodowych neuronów czuciowych (PSN) oraz komórek śródbłonka (EC), a także dowiedzieć się czy PSN wpływają na proces angiogenezy, Kannan oraz współpracownicy opracowali system hodowli komórkowej 3D, który składa się z ludzkich, embrionalnych komórek macierzystych (hESC) PSN oraz z komórek śródbłonka hESC osadzonych w macierzy kolagenowej typu 1⁵.
Z kolei Millesi i in. wykonali obrazowanie żywych komórek oraz manualne śledzenie hodowli fibroblastów i komórek Schwanna, aby zweryfikować czy szczurze fibroblasty wpływają na zachowanie migracyjne komórek Schwanna hodowanych na regeneracyjnym jedwabiu pajęczym².

Przeczytaj więcej na temat kultur komórkowych 3D tutaj (English).

Analiza funkcji oraz organizacji komórek neuronalnych przy użyciu obrazowania o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej

Obrazowanie komórek na żywo

Obrazowanie żywych komórek oraz tkanek umożliwia wgląd w procesy mechaniczne oraz funkcje neuronalne. Na przykład, za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (z ang. fluorescence lifetime imaging microscopy FLIM) ujawniono zmiany metaboliczne w skrawkach mózgu będące przyczyną dysfunkcji mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych⁶.

Warunki fizjologiczne

W przypadku długotrwałego obrazowania żywych komórek szczególnie istotne jest utrzymanie odpowiednich warunków fizjologicznych poprzez kontrolowanie temperatury, pH, wilgotności oraz poziomu tlenu. Dla przykładu, obrazowanie żywych neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w stabilnych warunkach środowiskowych, czyli 37°C i 5% tlenu pozwoliło na zobrazowanie polaryzacji oraz rozciągnięcia aksonów w wizualizacji 3D w czasie 48h⁷. W tym przypadku, neurony OUN zostały osadzone w hydrożelach kolagenowych, a następnie zobrazowane za pomocą mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w warunkach fizjologicznych, aby pokazać, że wzrost aksonów w strukturach 3D jest ameboidalny i niezależny od procesów adhezji⁷.

Przeczytaj więcej o obrazowaniu żywych komórek oraz warunkach fizjologicznych do pracy pod mikroskopem tutaj (English)..

W celu symulowania warunków fizjologicznych in vitro dla komórek śródbłonka, a w szczególności dla komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), kluczowym punktem jest utrzymanie hodowli w ściśle określonych warunkach naprężenia z jednoczesnym, ciągłym przepływem pożywki hodowlanej. Na przykład Gao i współpracownicy wykazali, że zmieniony przepływ krwi w mózgach myszoskoczków (w modelu ostrego uszkodzenia mózgu IR), wpływa na zmianę funkcjonowania śródbłonka mikronaczyniowego oraz neuronów⁸.

Przeczytaj więcej na temat kultur komórkowych w przepływie tutaj (English).

Obrazowanie komórek neuronalnych w super-rozdzielczości

W układzie nerwowym wiele struktur oraz procesów neuronalnych zachodzi w mniejszej skali niż granica rozdzielczości światła mikroskopowego. Dlatego też, trudno jest zobrazować istotne szczegóły, które są mniejsze niż 200 nm za pomocą konwencjonalnych technik mikroskopii świetlnej. Na szczęście rozwój super-rozdzielczości, czyli takich metod jak: strukturalna mikroskopia świetlna (SIM), mikroskopia wymuszonego wygaszania emisji (STED) lub mikroskopia lokalizacyjna z fotoaktywacją (PALM), umożliwia pokonanie bariery dyfrakcyjnej światła, a tym samym ułatwia wizualizację elementów tak małych jak pęcherzyki synaptyczne o wielkości 40 nm. Dla przykładu, Conaghi i współpracownicy byli w stanie po raz pierwszy zlokalizować poszczególne białka SENP w hodowli pierwotnych neuronów hipokampa za pomocą strukturalnej mikroskopii świetlnej (SIM)⁹.

Przeczytaj więcej o obrazowaniu w super-rozdzielczości tutaj (English)..

Obrazowanie wapnia w neuronach

Sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczową rolę w prawie wszystkich procesach komórkowych, np. w neuronach, jony Ca2+ są odpowiedzialne za uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych.

Obrazowanie wapnia umożliwia również monitorowanie aktywności elektrycznej neuronów poprzez śledzenie strumienia Ca2+ za pomocą sond fluorescencyjnych, które są aktywowane po związaniu się jonów wapnia. Ponadto, obrazowanie wapnia może być wykorzystywane jako narzędzie do oceny funkcjonalności komórek, na przykład podczas różnicowania się pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w neurony¹⁰.

Dowiedz się więcej o innych rozwiązaniach firmy ibidi do badań neurobiologicznych (English)..

Cytowane artykuły:

1. B. Bhat, N. Ljubojevic, S. Zhu, M. Fukuda, A. Echard, C. Zurzolo. Rab35 and its effectors promote formation of tunneling nanotubes in neuronal cells. Scientific reports, 2020, 10.1038/s41598-020-74013-z Przeczytaj
2. F . Millesi, T . Weiss, A. Mann, M. Haertinger, L. Semmler, P. Supper, D.Pils, A. Naghilou, C. Radtke. Defining the regenerative effects of native spider silk fibers on primary Schwann cells, sensory neurons, and nerve-associated fibroblasts. FASEB Journal. 2021, 10.1096/fj.202001447R Przeczytaj
3. G. Usseglio, E. Gatier, A. Heuzé, C. Hérent, J. Bouvier. Control of Orienting Movements and Locomotion by Projection-Defined Subsets of Brainstem V2a Neurons. Current Biology, 2020. 10.1016/j.cub.2020.09.014. Przeczytaj
4. D. Reim, T.M. Weis, S. Halbedl, J.P. Delling, A.M. Grabrucker, T.M. Boeckers, M.J. Schmeisser. The Shank3 Interaction Partner ProSAPiP1 Regulates Postsynaptic S.PAR Levels and the Maturation of Dendritic Spines in Hippocampal Neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscice, 2016. 10.3389/fnsyn.2016.00013 Przeczytaj
5. S. Kannan, M. Lee, S. Muthusamy, A. Blasiak, G. Sriram, T. Cao. Peripheral sensory neurons promote angiogenesis in neurovascular models derived from hESCs. Stem Cell Research, 2021, 10.1016/j.scr.2021.102231. Przeczytaj
6. E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larsson. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances, 2020, 10.1126/sciadv.aba8271 Przeczytaj
7. T. E. Santos, B. Schaffran, N. Broguière, L. Meyn, M. Zenobi-Wong, F. Bradke. Axon Growth of CNS Neurons in Three Dimensions Is Amoeboid and Independent of Adhesions. Cell Reports, 2021, 10.1016/j.celrep.2020.107907 Przeczytaj
8. J. Q. Gao, P. Wang, J. W. Yan, L. N. Ba, P. L. Shi, H. M. Wu, X. Y. Guan, Y. G. Cao, H.L. Sun, X. Y. Mao. Shear Stress Rescued the Neuronal Impairment Induced by Global Cerebral Ischemia Reperfusion via Activating PECAM-1-eNOS-NO Pathway. Frontiers in cell and developmental biology, 2021, 10.3389/fcell.2020.631286 Przeczytaj
9. L. Colnaghi, A. Conz, L. Russo, C.A. Musi, L. Fioriti, T. Borsello, M. Salmona. Neuronal Localization of SENP Proteins with Super Resolution Microscopy. Brain Sciences, 2020, 10.3390/brainsci10110778 Przeczytaj
10. F. Bianchi, M. Malboubi, Y. Li, J. H. George, A. Jerusalem, F. Szele, M. S. Thompson, H. Ye. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research, 2018, 10.1016/j.scr.2018.09.006 Przeczytaj

Oryginalny artykuł znajduję się na stronie ibidi.