TKANKI - Problemy odtwarzalności wyników w komorach hipoksyjnych oraz ich proste rozwiązanie
W ciągu ostatnich dwóch dekad, naukowcy zdali sobie sprawę, że w większości dziedzin naukowych istnieją niezliczone przykłady badań, które wykazują poważne problemy z odtwarzalnością wyników. Ze względu na fakt, że odtwarzalność warunków eksperymentu stanowi kluczowy punkt do uzyskania właściwych wyników, naukowcy starają się lepiej przyjrzeć się własnym konfiguracjom eksperymentalnym i znaleźć przyczyny, dlaczego pojawiają się problemy związane z odtwarzalnością. Jednym z obszarów badań nad komórkami, który stale rozwija się i zapewnia fizjologicznie istotne i odtwarzalne mikrośrodowisko, są stacje robocze oraz inkubatory hipoksyjne/fizjoksyjne. Systemy te modulują warunki tlenowe, a także umożliwiają komórkom wzrost w środowiskach, które najbardziej imitują naturalne warunki in vivo.
Biorąc pod uwagę, że coraz więcej badań wykorzystuje środowiska fizjoksyjne, to dlaczego nadal pojawiają się problemy z odtwarzalnością wyników? Cóż, okazuje się, że większość używanych obecnie inkubatorów hipoksyjnych/fizjoksyjnych posiada podstawową wadę, która polega na tym, że systemy nie są w stanie w pełni odtworzyć wyników z tego samego dnia lub z sezonu na sezon lub z jednej lokalizacji do drugiej lokalizacji. Prosty problem polega na tym, że systemy te wykorzystują względny pomiar tlenu w środowisku (czyli procent), co ogranicza możliwość dokładnego porównywania wyników w różnym czasie lub w różnych lokalizacjach. Proste przejście na odczytywanie poziomu tlenu w jednostkach bezwzględnych ciśnienia parcjalnego (takich jak mmHg lub kPa) może rozwiązać ten problem.
Pytania, które należy rozważyć, to: Dlaczego pomiary względne (czyli procentowe) są używane do pomiaru i kontroli poziomu tlenu i czy bardziej odpowiedni byłby pomiar bezwzględny w jednostkach takich jak mmHg lub kPa? Jakie są nieodłączne problemy związane ze stosowaniem wartości procentowych w inkubatorach z trójgazem lub do hipoksji? I wreszcie, czy nastąpi zmiana z pomiarów względnych na bezwzględne i kto może o tym decydować?
Dostępność tlenu zmniejsza się wraz z wysokością
Kontrolowanie zawartości tlenu w komorze wewnętrznej za pomocą wartości procentowych nie uwzględnia zmian ciśnienia barometrycznego, które mogą zmieniać się nawet o +/- 5% w ciągu jednego dnia w dowolnej lokalizacji geograficznej. Na przykład, jeśli użytkownik ustawi komorę na 8% zawartości tlenu, a ciśnienie atmosferyczne spadnie o 5%, to nieświadomie naraża komórki na zmniejszenie tlenu do 5%. Natomiast, jeśli użytkownik ustawi komorę na 38 mmHg O2, a ciśnienie atmosferyczne spadnie o 5%, to gęstość tlenu w atmosferze komory wewnętrznej pozostanie stała. Zmiany te są poważnym problemem, ponieważ większość badaczy prowadzi swoje eksperymenty przez wiele dni, a nawet tygodni, w których zmiany pogodowe oraz sezonowe są nieuniknione. Niezmiernie istotne jest, aby naukowcy mogli odtwarzać te same warunki O2 niezależnie od tego, kiedy używają systemu. Dlatego ważna jest świadomość, że warunki w komorze mogą zmieniać się z dnia na dzień, co może wiązać się ze znacznymi odchyleniami w przypadku systemu korzystającego z pomiarów procentowych.
Co więcej, pomiary procentowe nie uwzględniają wysokości nad poziomem morza. Chociaż jest to znacznie mniejszy problem, to nadal jest to wysoce istotny czynnik dla nauki prowadzonej w takich miejscach jak Denver w Kolorado, gdzie średnie ciśnienie O2 wynosi 633 mmHg w porównaniu do ciśnienia w innych miejscowościach znajdujących się na wysokości poziomu morza, gdzie ciśnienie osiąga 760 mmHg. Jest to różnica aż 16,7%, która nie jest uwzględniana przy użyciu względnego pomiaru procentowego. W związku z tym, dokładne odtworzenie eksperymentów z jednego laboratorium do drugiego może stać się dużym wyzwaniem. Nie jest to nowy problem, dlatego wszyscy badacze zajmujący się hipoksją muszą być świadomi swoich różnic w wynikach, jeśli stosują pomiary procentowe. Wydaje się, że niektórzy z najbardziej długoletnich badaczy w tej dziedzinie rozumieją ten problem i robią wszystko co w ich mocy, aby przeliczyć swoje wyniki procentowe na pO2 przy użyciu lokalnych ciśnień barometrycznych, ale niestety nie jest to nadal ustandaryzowana metoda.
Stosowanie pomiarów procentowych prowadzi do częstszych powtórzeń i stawiania sobie większej liczby pytań, podczas gdy jednostki bezwzględne dają ostateczny wynik pomiaru. Używając jednostek bezwzględnych, nie trzeba zgadywać, czy wysokość lub wahania dziennego ciśnienia atmosferycznego wpłynęły na końcowe wyniki. W badaniach, w których różnica pomiędzy wzrostem, a różnicowaniem jest niewielka, naukowcy powinni pamiętać, aby standardem były bezwzględne jednostki tlenu. W czasach, gdy rośnie presja, aby móc zapewnić odtwarzalne warunki badań, a czasopisma naukowe stają się coraz bardziej rygorystyczne, bezwzględne jednostki tlenu zapewniają gwarancję, że naukowcy uwzględniają kluczowe czynniki, który mogą wpłynąć na ich końcowe wyniki.
Na koniec, wydaje się, że istnieje również rozbieżność w aktualnej literaturze, w której badania in vivo oraz in vitro cytowane są w zupełnie różnych jednostkach. Dla przykładu: badania tlenu w tkankach prawie zawsze wyrażane są jako ciśnienie cząstkowe, natomiast naukowcy przeprowadzający badania komórkowe za pomocą inkubatórow hipoksyjnych/fizjoksyjnych porównują wyniki swoich komórek do wyników uzyskanych w tkankach przy użyciu funkcji procentowej (a nie jednostki bezwzględnej). Stwarza to pozornie niemożliwe do uniknięcia rozbieżności, ponieważ nie ma solidnych podstaw naukowych, dla których tlen tkankowy oraz komórkowy miałby być wyrażany przy użyciu różnych jednostek. W przypadku standardowego porównania np. jabłek do jabłek, to bezwzględny pomiar stosowany w badaniach komórkowych sprowadziłby badania in vivo oraz in vitro na tę samą płaszczyznę.
Dalsze działania
Mając na uwadze wszystkie wymienione wcześniej czynniki, dlaczego producenci komór hipoksyjnych nie zmieniają swoich urządzeń na system kontroli ciśnienia parcjalnego? A przynajmniej dlaczego nie wprowadzają takiej opcji? Technologia, która to umożliwia, jest obecnie szeroko dostępna, a także łatwiejsza do wdrożenia niż kiedykolwiek wcześniej. Być może dzieje się tak dlatego, że pomiar procentowy jest nadal powszechnie akceptowalny, a naukowcy są zadowoleni. Tak jak to w przypadku wszystkich postępów naukowych, po pełnym zrozumieniu, że istnieje lepszy i bardziej powtarzalny sposób prowadzenia, wydaje się, że pomiary ciśnienia parcjalnego prawie na pewno staną się normą. Jeśli zmiana ta pozwoli badaczom uniknąć wieloletniej analizy z powodu braku możliwości odtworzenia wyników w innym laboratorium, będzie to dużym przełomem osiągniętym niewielkim wysiłkiem, ale zmieniającym długoletnie i błędne nawyki.
Powoli staje się również jasne, że kluczowe czasopisma naukowe wyłapują problemy związane z brakiem odtwarzalności wyników, dlatego nadsyłane manuskrypty będą zapewne poddawane jeszcze większym restrykcjom i kontrolom. W związku z tym, możliwość kontrolowania dokładnej ilości tlenu, którą „widzą” komórki (niezależnie od jakiegokolwiek innego czynnika), powinna stać się głównym celem badań w przyszłości. Jeśli głównym celem systemów fizjoksyjnych jest ścisła modulacja poziomu O2, to należy stanowczo przyjąć miarę bezwzględną, która może skompensować zmianę ciśnienia (gęstości) poprzez dostosowanie ciśnienia parcjalnego tlenu. Warto również zauważyć, że jedna z najbardziej dogłębnych analiz normoksji fizjologicznej autorstwa Keeley i Mann (2018) wydaje się w pełni ujmować ten problem, stwierdzając: „Idealny poziom O2 powinien być definiowany w jednostkach ciśnienia parcjalnego (mmHg lub kPa) zgodnie z prawem Henry'ego”. Dlatego też, należy dołożyć wszelkich starań, aby ujednolicić wszystkie cytowane badania dotyczące kPa.
Komora fizjoksyjna HypoxyLab firmy Oxford Optronix Ltd.
Podczas, gdy prawie wszystkie obecnie dostępne na rynku komory do hipoksji oraz inkubatory trójgazowe nadal wykorzystują procentową jednostkę pomiaru zawartości tlenu, to komora HypoxyLab firmy Oxford Optronix z Wielkiej Brytanii wyróżnia się jako pierwszy system do kontrolowania środowiska wewnętrznego przy użyciu bezwzględnych jednostek tlenu. Model HypoxyLab to w pełni kompaktowy i niezależny inkubator przeznaczony do hipoksji/fizjoksji, który wykorzystuje ciśnienie parcjalne do pomiaru i kontroli środowiska tlenowego. Ze względu na fakt, że za sukcesem tego modelu stoją dowody naukowe dotyczące pomiaru tlenu bezwzględnego, to wszyscy naukowcy potrzebujący precyzyjnej kontroli tlenu w swoich badaniach, powinni zwrócić uwagę na ten system.
Referencje
McKeown SR. Defining Normoxia, Physoxia and Hypoxia in Tumours—Implications for Treatment Response. Br J Radiol 2014; 87: 20130676
Keeley TP & Mann GE. Defining Physiological Normoxia for Improved Translation of Cell Physiology to Animal Models and Humans. Physiological Reviews 2018; Vol 99:1
Oryginalny artykuł dostępny na stronie Oxford Optronix tutaj.
