Komórki - Wgląd w mechanistyczne tworzenie się synapsy immunologicznej w trakcie odpowiedzi immunologicznej
Autor: Manuel Izquierdo z Departamentu Biochemii, Instytut Badań Biomedycznych Alberto Sols CSIC-UAM, Wydział Lekarski Uniwersytetu Autonomicznego w Madrycie, Hiszpania
Komórkowa odpowiedź immunologiczna wywierana przez limfocyty T to niezbędny proces organizmu w walce z patogenami, w tym z wirusem odpowiedzialnym za COVID. Obecnie najskuteczniejszymi szczepionkami są te, które posiadają zdolność do wywoływania skutecznej oraz trwałej odpowiedzi immunologicznej, zarówno humoralnej (poprzez aktywację limfocytów B i produkcji przeciwciał), jak i komórkowej (czyli aktywacji limfocytów T oraz generowanie tzw. limfocytów T pamięci) w immunizowanym organizmie. Komórki T pamięci „zapamiętują patogen”, a także posiadają receptor antygenowy, który jest zdolny do rozpoznawania antygenów danego patogenu (np. wirusa), dlatego przy następnym kontakcie z patogenem, gdy wystąpi infekcja, organizm jest zdolny do uśmiercenia zakażonej komórki. Znajomość podstawy molekularnej, w kontekście tworzenia synaps immunologicznych, która reguluje aktywność limfocytów T skierowanych specyficznie przeciwko patogenom, jest kluczowym punktem do tworzenia oraz modyfikowania odpowiedzi limfocytów, co w konsekwencji pozwala na opracowanie nowych strategii szczepień.
Obraz konfokalny limfocytu T typu Jurkat (na dole) w trakcie tworzenia synapsy immunologicznej z komórką prezentującą antygen (kolor niebieski, na górze). Filamenty aktynowe zobrazowano w kolorze zielonym, natomiast ciałka wielopęcherzykowe w kolorze różowym. Komórki zostały zobrazowane na 8-dołkowej mikropłytce ibidi µ-Slide.
Aktywacja limfocytów T oraz B przez komórki prezentujące antygen (tzw. APC) zachodzi na wyspecjalizowanym styku komórka-komórka zwanym synapsą immunologiczną (IS). Uformowanie IS przez limfocyty T i B jest bardzo dynamicznym, plastycznym, a także krytycznym momentem, który można opisać jako dostrajalna platforma sygnalizacyjna integrująca zarówno sygnały przestrzenne, mechaniczne jak i biochemiczne. Wszystkie te sygnały są zaangażowane w tworzenie odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla danego antygenu (zarówno odpowiedzi komórkowej jak i humoralnej) (de la Roche i in., 2016) (Fooksman i in., 2010). Tak więc, tworzenie IS poprzez limfocyty T oraz B stanowi kluczowy punkt podczas odpowiedzi immunologicznych.
Co więcej, formowanie się synapsy immunologicznej jest związane z początkowym wzrostem zawartości korowej aktyny F w IS (Billadeau et al., 2007), po którym następuje spadek gęstości F-aktyny w centralnym regionie IS obejmującym domenę wydzielniczą (Griffiths et al., 2010; Ritter i in., 2010). Podstawowe szlaki sygnałowe regulujące aktynę obejmują procesy fosforylacji poprzez aktywność kinaz białkowych C (z rodziny kinaz PKC) (Griffiths i wsp., 2010; Xie i wsp., 2013).
Po utworzeniu synapsy immunologicznej przez limfocyty T oraz komórki prezentujące antygen (APC), następuje konwergencja pęcherzyków wydzielniczych (w tym ciałek wielopęcherzykowych MVB) w kierunku centralnej organizacji mikrotubul (MTOC), po czym dochodzi do polaryzacji MTOC do IS, które są zaangażowane w spolaryzowane wydzielanie w szczelinie synaptycznej. Procesy spolaryzowanego wydzielania egzosomów w synapsie immunologicznej jest stale rozwijającym się obszarem badań zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne (Colombo i wsp., 2014). Wykazano, że wewnątrzkomórkowe ziarnistości, czyli ciałka wielopęcherzykowe (MVB), są otoczonymi przez CD63, które przenoszą tzw. pęcherzyki światła endosomu (ILV). Ciałka te doświadczają spolaryzowanego transportu w kierunku IS (Alonso i wsp., 2011; Mazzeo i wsp., 2016; Wideo 1) po stymulacji TCR przez antygen. Fuzja MVB w błonie synaptycznej indukuje ich degranulację, a także uwalnianie ILV jako egzosomów do szczeliny synaptycznej (Alonso i wsp., 2011; Mittelbrunn i wsp., 2011).
Wideo 1: Polaryzacja synaps immunologicznych oraz ciałek wielopęcherzykowych.
Obrazowanie żywych komórek (52 min; 3 fps) wychwytujące tworzenie się podwójnej synapsy pomiędzy komórką Jurkat transfekowaną GFP-CdC63 (kolor zielony) oraz dwiema komórkami Raji (kolor niebieski). Następnie widoczny jest spolaryzowany ruch ciałek wielopęcherzykowych (pęcherzyki znakowane GFP-CD63) w obszarze kontaktu synaptycznego w komórkach tworzących synapsę (pośrodku), ale nie w dwóch komórkach Jurkat, które nie formują synaps (po lewej). Komórki obrazowano na 8 dołkowych mikropłytkach ibidi µ-Slide.
Najprawdopodobniej, ten wyspecjalizowany mechanizm zapewnia układowi odpornościowemu precyzyjnie dostrojoną strategię, która po pierwsze pozwala na zwiększenie wydajności kluczowych funkcji wydzielniczych u efektorowych limfocytów T, po drugie minimalizuje jednocześnie niespecyficzną stymulację komórek postronnych wywoływaną przez cytokiny, aż finalnie pozwala na uśmiercenie komórek docelowych poprzez wywołaną aktywację (Calvo i Izquierdo, 2018).
Głównym przedmiotem zainteresowania tego eksperymentu było zbadanie podstaw molekularnych zaangażowanych w spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku IS w limfocytach T. W ten sposób opracowano różnorodne modele, a także kilka strategii obrazowania, które umożliwiły na uzyskanie wglądu w mechanizmy rządzące kierunkowym ruchem wydzielniczym.
Opracowano kilka najnowocześniejszych metod obrazowania opartych na analizie żywych komórek, które pozwoliły na zbadanie mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw kluczowej odpowiedzi sekrecyjnej układu odpornościowego, jak zostało to podsumowane w artykule Calvo i Izquierdo z 2018 roku.
W naszym laboratorium został opracowany protokół, który pozwolił na wizualizację wczesnych etapów powstawania IS, a także późniejszego, spolaryzowanego ruchu wydzielniczego w kierunku IS z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek (wideo 1).
Do tego celu poddaliśmy stymulacji komórki B Raji, które zostały opłaszczone superantygenem gronkowca enterotoksyny E (SEE) (Montoya i wsp., 2002) wraz z limfocytami T Jurkat. Stymulacji takiej można dokonać w zawiesinie komórek hodowlanych, ale również przy użyciu komórek B Raji przyczepionych do szkiełek nakrywkowych pokrytych fibronektyną (8-dołkowe mikroszkiełka ibidi µ-Slide).
Aby zbadać rolę reorganizacji F-aktyny w obszarze synaptycznym w trakcie tworzenia się synaps, porównaliśmy architekturę aktyny w koloniach kontrolnych oraz w ludzkich komórkach Jurkat z ingerencją PKCdelta. Późniejsze utrwalanie oraz immunoznakowanie ujawniło zubożenie gęstości F-aktyny w centralnym regionie formowania się synapsy w próbkach kontrolnych w przeciwieństwie do kolonii komórek z ingerencją P5 PKCdelta (wideo 2). Wynik ten prowadzi do wniosku, że usuwanie F-aktyny zależne od PKCdelta jest wymagane do wydajnej sekrecji egzosomów.
Wideo 2: Architektura F-aktyny w miejscu tworzenia się synapsy immunologicznej w komórkach z deficytem PKCdelta.
Projekcja 3D utrwalonych komórek Jurat (kontrola, C3 oraz PKCdelta, P5) wyznakowana CMAC (kolor niebieski) 1 godzinę po utworzeniu koniugatu synapsy. F-aktynę wizualizowano za pomocą falloidyny-488 (kolor zielony). Białe prostokąty w ramce nr. 1 odpowiadają immunologicznemu interfejsowi synapsy.
Pierwszy fotogram z pliku wideo odpowiada widokowi z góry koniugatu synaptycznego, podczas gdy ostatnia klatka przedstawia immunologiczny obszar kontaktu synaps (tzw. interfejs synaptyczny) pod kątem 90 stopni względem obserwatora. Panele górne: połączone kanały CMAC oraz falloidyny. Dolne panele: powiększony obszar synaps immunologicznych dla kanału falloidyny (powiększenie 1,5x i 2,5x dla komórki kontrolnej (C3) oraz komórki PKCdelta (P5); białe prostokąty w górnych panelach). W obu komórkach widoczna jest akumulacja F-aktyny w obszarach styku synaptycznego (zamkniętych w białe prostokąty). Jednak ubytek F-aktyny w centralnym obszarze połączenia synaptycznego jest obserwowany tylko w grupie kontrolnej w przeciwieństwie do komórek z deficytem P5 PKCdelta, co uwidoczniono pod koniec filmu, gdy interfejs synaptyczny znajduje się pod kątem 90 stopni względem obserwatora.
Manuel uzyskał tytuł doktora w Szpitalu de la Princesa w Madrycie na podstawie swojej pracy badawczej dotyczącej immunologicznej rekonstrukcji limfocytów T po przeszczepie szpiku kostnego (1986-1990). Następnie w latach 1990-1994 Manuel pracował jako adiunkt w ICRF (Londyn, Wielka Brytania) nad sygnałami wewnątrzkomórkowymi zaangażowanymi w aktywację p21ras oraz funkcją p21ras w limfocytach T. Po tym czasie powrócił do Hiszpanii i pracował jako post-doktorant (1994-1996) w Instytucie Biomedycyny i Parazytologii „López Neyra” (CSIC, Granada), gdzie badał sygnały zaangażowane w apoptozę limfocytów T. Z kolei w latach 1997-1999 Manuel pracował jako adiunkt w Zakładzie Immunologii i Onkologii CNB (CSIC, Madryt), analizując funkcję kaspaz zaangażowanych w procesy selekcji negatywnej w grasicy. W 2000 roku Manuel uzyskał stanowisko Stałego Naukowca w CSIC (IBGM, CSIC, Valladolid), gdzie pracował jako główny badacz w dwóch różnych obszarach: 1) zajmował się badaniem sygnałów wewnątrzkomórkowych zaangażowanych w aktywację oraz zaprogramowaną śmierć komórek limfocytów T; 2) a także analizował mechanizmy molekularne związane w sekrecję egzosomów w synapsie immunologicznej wytwarzanej przez limfocyty T. Z kolei w 2004 r. Manuel przeniósł się do IIB „Alberto Sols” (IIBM, CSIC, Madryt), gdzie w 2009 r. awansował na Starszego Naukowca (CSIC) i pozostaje tam aktywny do dziś.
Zainteresowania Manuela związane są z zastosowaniem zaawansowanych technik obrazowania żywych limfocytów T (Obrazowanie oraz analiza obrazu w wysokiej rozdzielczości), a także z multidyscyplinarnymi technikami (np. nanotechnologia) przeznaczonymi do badania synapsy immunologicznej.
Referencje
Alonso, R., Mazzeo, C., Rodriguez, M.C., Marsh, M., Fraile-Ramos, A., Calvo, V., Avila-Flores, A., Merida, I., and Izquierdo, M. (2011). Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death Differ 18 , 1161-1173.
Billadeau, D.D., Nolz, J.C., and Gomez, T.S. (2007). Regulation of T-cell activation by the cytoskeleton. Nat Rev Immunol 7 , 131-143.
Calvo, V., and Izquierdo, M. (2018). Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Front Immunol 9 , 684.
Calvo, V., and Izquierdo, M. (2021). Role of Actin Cytoskeleton Reorganization in
Polarized Secretory Traffic at the Immunological Synapse. Front. Cell Dev. Biol., 4
Colombo, M., Raposo, G., and Théry, C. (2014). Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology 30 , 255-289.
De La Roche, M., Asano, Y., and Griffiths, G.M. (2016). Origins of the cytolytic synapse. Nat Rev Immunol 16 , 421-432.
Fooksman, D.R., Vardhana, S., Vasiliver-Shamis, G., Liese, J., Blair, D.A., Waite, J., Sacristan, C., Victora, G.D., Zanin-Zhorov, A., and Dustin, M.L. (2010). Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annu Rev Immunol 28 , 79-105.
Fuss, I.J., Kanof, M.E., Smith, P.D., and Zola, H. (2009). Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol Chapter 7 , Unit7 1.
Griffiths, G.M., Tsun, A., and Stinchcombe, J.C. (2010). The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. J Cell Biol 189 , 399-406.
Jambrina, E., Alonso, R., Alcalde, M., Del Carmen Rodriguez, M., Serrano, A., Martinez, A.C., Garcia-Sancho, J., and Izquierdo, M. (2003). Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. J Biol Chem 278 , 14134-14145.
Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., and Izquierdo, M. (2016). Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death Differ 23 , 99-109.
Mittelbrunn, M., Gutierrez-Vazquez, C., Villarroya-Beltri, C., Gonzalez, S., Sanchez-Cabo, F., Gonzalez, M.A., Bernad, A., and Sanchez-Madrid, F. (2011). Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun 2 , 282.
Montoya, M.C., Sancho, D., Bonello, G., Collette, Y., Langlet, C., He, H.T., Aparicio, P., Alcover, A., Olive, D., and Sanchez-Madrid, F. (2002). Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nat Immunol 3 , 159-168.
Ritter, A.T., Asano, Y., Stinchcombe, J.C., Dieckmann, N.M., Chen, B.C., Gawden-Bone, C., Van Engelenburg, S., Legant, W., Gao, L., Davidson, M.W., Betzig, E., Lippincott-Schwartz, J., and Griffiths, G.M. (2015). Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity 42 , 864-876.
Xie, J., Tato, C.M., and Davis,M.M. (2013). How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunol. Rev. 251, 65–79. doi: 10.1111/imr.12017
