Komórki - Pięć kluczowych etapów do uzyskania doskonałego obrazu immunofluorescencyjnego komórki

Rozwój najnowszych technologii obrazowania w wysokiej rozdzielczości umożliwia naukowcom wizualizację struktur komórkowych na poziomie submikronowym, a nawet w tzw. nano-skali dzięki zastosowaniu barwienia immunofluorescencyjnego. Metoda ta wymaga przeprowadzenia dokładnych optymalizacji podczas przygotowywania próbki, w celu uzyskania obrazów o najlepszej jakości obrazu, a co za tym idzie, protokoły mogą stawać się coraz bardziej wymagające wraz ze wzrostem rozdzielczości obrazu.

Mimo, że „optymalne” protokoły są dostarczane przez producentów danych przeciwciał, to niestety nie istnieje standardowa procedura, którą można by zastosować do wszystkich typów próbek. Dlatego też, znaczną część czasu zabiera naukowcom optymalizacja tej techniki, która jest oparta w dużej mierze na zasadzie prób i błędów.

W teorii, protokoły barwienia immunofluorescencyjnego składają się z sześciu podstawowych etapów i są to kolejno: utrwalanie, permeabilizacja, blokowanie, inkubacja przeciwciał pierwotnych oraz wtórnych, a następnie zapisywanie obrazu. Jednak na każdym etapie istnieje wiele drobnych szczegółów, które gdy zostaną wykonane w nieprawidłowy sposób, mogą mieć wpływ na to czy uzyskany obraz immunofluorescencyjny jest dobrej lub złej jakości.

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego u szczura Lewis wybarwione przeciwciałem anty-króliczym PCNA (przedstawionym w kolorze różowym), przeciwciałem przeciwko alfa-tubulinie (przedstawionym w kolorze zielonym) oraz falloidyną (przedstawionym w kolorze czerwonym). Obraz uzyskano przy zastosowaniu mikroskopu konfokalnego Leica SP8.

Od momentu, gdy wszedłem do środowiska badawczego jako student mgr inż. w 2017 roku, zajmuję się analizowaniem różnych typów mezenchymalnych komórek macierzystych oraz tkanek zarodkowych w celu zbadania procesu regeneracji oraz rozwoju twarzoczaszki. I wtedy właśnie zanurzyłem się w świat barwień immunofluorescencyjnych. Do tej pory wykonałem niezliczoną ilość obrazów, w tym nawet obraz na okładkę do numeru „Journal of Dental Research”, który zawierał moją pierwszą publikację (Yamada i in., 2019). Po spędzeniu około 300 godzin rocznie na obrazowaniu fluorescencyjnym, odkryłem idealny protokół do przeprowadzenia barwień immunofluorescencyjnych, który doskonale pasował do moich komórek oraz aplikacji. Nauczyłem się, że kilka drobnych poprawek może naprawdę wiele zmienić w finalnym obrazie!

W tym artykule chciałbym podzielić się moimi 5-cioma podstawowymi, ale często pomijanymi krokami optymalizacji, które pozwolą na poprawę Twoich obrazów immunofluorescencyjnych.

1. Dobrze zapoznaj się ze swoim docelowym białkiem i ustal odpowiedni protokół utrwalania

Pierwszą kluczową kwestią, którą należy podjąć, jest decyzja jaki utrwalacz należy zastosować do danej próbki. Różnorodne utrwalacze, w tym aldehydy (np. paraformaldehyd PFA), alkohole (np. zimny metanol) czy roztwory na bazie kwasów (np. kwas trichlorooctowy) wykazały doskonałą kompatybilność z immunofluorescencją, jednak każdy z tych utrwalaczy posiada zarówno swoje zalety jak i minusy. Na sam początek dobrymi kandydatami są PFA oraz metanol. O różnicach w ich właściwościach utrwalających można się dowiedzieć z literatury (np. Eldred i in., 1983).

Niezależnie od tego jaki utrwalacz wybierzesz, kluczowe znaczenie będzie miała optymalizacja czasu trwania utrwalania. Należy unikać nadmiernej fiksacji, ponieważ powoduje ona destrukcyjny wpływ na komórki, a także pogarsza proces rozpoznawanie przeciwciał (ryc. 1A). Niemniej jednak, należy również unikać niedostatecznej fiksacji, ponieważ pozwala to na migrację białka docelowego z jego miejsc natywnych do bardziej zewnętrznych warstw. Prowadzi to nie tylko do otrzymania niewyraźnych obrazów, ale także do barwienia fałszywie dodatniego, co znacznie wpływa na końcowy wynik badania.

Oprócz odpowiedniego czasu utrwalania, niezmiernie istotna jest również temperatura tego procesu. Niska temperatura sprawi, że reakcja będzie zachodzić bardzo wolno, dzięki czemu będzie ona mniej destrukcyjna dla komórek, ale z drugiej strony może ona dać białkom czas na poruszanie się zanim zostaną unieruchomione. Ogólnie rzecz ujmując, utrwalanie w niskich temperaturach jest korzystne, gdy stosuje się silne/natychmiastowe utrwalacze, takie jak zimny metanol. W przypadku łagodniejszych utrwalaczy, takich jak PFA, lepszą opcją może być utrwalanie w temperaturze pokojowej (przynajmniej dla komórek jednowarstwowych).

Kiedyś, wręcz na ślepo postępowałem zgodnie z zasadą „4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej”. Jednak dopiero później odkryłem, że moje próbki były niedopracowane i przez to zmarnowałem zarówno dużo swojego czasu jak i odczynników. Może nie zdarzać się to zbyt często, ale niestety zdarza się. W razie wątpliwości lepiej dokładnie sprawdzić protokół utrwalania!

Fig. 1A: Przykład nadmiernego utrwalania. Metanol stosowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Alfa-tubulina wybarwiona na czerwono, natomiast jądra komórkowe za pomocą DAPI na niebiesko.

Fig. 1B: Przykład prawidłowo utrwalonych komórek: zastosowano zimny metanol przez 5 minut w temperaturze -20 stopni. Alfa-tubulina przedstawiona w kolorze czerwonym, natomiast jądra komórkowe za pomocą DAPI na niebiesko.

2. Określenie kiedy i jakiego detergentu użyć (lub nie)

W sytuacjach, gdy wymagana jest permeabilizacja, to zwykle standardowe detergenty niejonowe  (takie jak: Triton X-100 czy Tween-20) są zazwyczaj zawarte zarówno w buforze permeabilizującym, jak i w buforze blokującym, buforze myjącym oraz buforze barwiącym. Dzieje się tak, ponieważ zastosowanie detergentu faktycznie poprawia skuteczność blokowania, a także pozwala na usunięcie nieswoistych wiązań przeciwciała podczas kolejnych etapów płukania. Jeśli jednak białko docelowe (zwłaszcza występujące w błonie komórkowej lub w cytoszkielecie) pojawia się na obrazach mniej obficie niż zakładano, to najprawdopodobniej detergent zakłócił proces barwienia immunologicznego.

Triton X-100 oraz Tween-20 posiadają różnorodne właściwości chemiczne, ale co najważniejsze, Triton X-100 jest przepuszczalny przez błonę komórkową silniej niż Tween-20. Jeśli Triton X-100 został już zastosowany na etapie permeabilizacji, to do nas należy wybór, czy chcemy nadal używać Triton X-100 w pozostałych buforach (tj. w buforze do mycia, blokowania i barwienia) czy też lepiej przestawić się na Tween-20 lub nawet kontynuować bez dodatkowego detergentu. Alternatywnie, można zastosować Tween-20 tylko do permeabilizacji. I na koniec, warto pamiętać, że czasami w ogóle nie jest potrzebny żaden detergent.

3. Niskie stężenie, ale dłuższy czas inkubacji

Stosowanie jak najniższego stężenia przeciwciał jest niezwykle istotne dla zwiększenia stosunku sygnału do tła. Zawsze zalecam określenie najniższego stężenia roboczego za pomocą miareczkowania przeciwciał (nawet jeśli producent zaproponował już optymalne stężenie). Ogólnie rzecz ujmując, dłuższa inkubacja (np. przez całą noc, w temperaturze 4°C ) z niskim stężeniem przeciwciał zapewnia ostrzejszy, silniejszy i bardziej wyraźne barwienie w porównaniu z krótszymi inkubacjami z wysokim stężeniem przeciwciał. Miareczkowanie przeciwciał jest zwykle pracochłonne i wymaga dodatkowych środków, ale warto zastosować tę metodę, aby ustalić optymalne stężenie danego przeciwciała.

4. Płukanie, płukanie i jeszcze raz płukanie

Płukanie jest prawdopodobnie najważniejszym etapem całego procesu barwienia immunofluorescencyjnego. Uwierz mi, nigdy nie pożałujesz dodatkowych kroków płukania! Dopóki stosujemy przeciwciało o wysokiej jakości, to wiązanie antygen-przeciwciało jest wystarczająco silne, aby tolerować dodatkowe etapy płukania. Warto pamiętać, że każde płukanie pozwala na skuteczne usunięcie słabo lub niespecyficznie związanych przeciwciał. Tak, wiem, możesz pomyśleć, że „to jest tak czasochłonne i monotonne”. Zgadzam się, ale płukanie naprawdę powoli na otrzymanie jeszcze lepszych obrazów immunofluorescencyjnych! Najlepiej dodaj jeszcze jeden lub dwa etapy płukania, a w tym czasie będziesz mógł mieć przerwę na filiżankę herbaty.

5. Znajdź odpowiedni sprzęt optyczny

I ostatni etap, czyli wizualizacja obrazu. Drobne szczegóły widoczne na obrazach są rejestrowane tylko wtedy, gdy wszystkie systemy optyczne są dobrze zoptymalizowane. Jeśli na co dzień robisz zdjęcia, to zapewne masz świadomość, że wysokiej klasy obiektywy są często dużo droższe niż sam aparat (np. system czujników). Dzieje się dlatego, że na opracowanie delikatnego szkła oraz powłok przeznacza się o wiele więcej czasu oraz zasobów. Tak naprawdę można powiedzieć, że to jakość obiektywów decyduje o jakości naszych zdjęć. Ta sama teoria dotyczy również systemów mikroskopowych. Układy optyczne mikroskopu są kluczowym wyznacznikiem ostatecznej jakości obrazu. Ciekawostka: jest to element, o który producenci mikroskopów zaciekle konkurują między sobą, aby jeszcze lepiej rozwijać swoją technologię!

I teraz słyszę, jak mówisz: „Nie możemy zmienić systemu optycznego naszego mikroskopu”. W rzeczywistości jest coś, co zawsze można zmienić, a co drastycznie wpłynie na wyniki obrazowania niezależnie od posiadanego sprzętu. Są to szkiełka nakrywkowe oraz komory do obrazowania, których używasz do hodowli lub umieszczania komórek i próbek! Tak, te małe elementy są wykonane z cienkiego szkła lub plastiku i są całkowicie przezroczyste dla ludzkiego oka, ale każdy z nich (przez który przechodzi światło/laser) posiada znaczący wpływ na ostateczny wynik obrazowania.

I w tym miejscu do gry wchodzą szkiełka ibidi µ-slides z polimerowym dnem! Komory oraz szkiełka nakrywkowe ibidi µ-slide zostały opracowane w celu zapewnienia doskonałej jakości optycznej w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Do standardowego obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości (np. w mikroskopie kontrastowo-fazowym, mikroskopie konfokalnym lub mikroskopie 2-fotonowym) zalecana jest wersja polimerowa (ibiTreat) ze szkiełkiem nakrywkowym o grubości 180 µm (nr: 1,5). Natomiast  idealnym rozwiązaniem do mikroskopii TIRF o super rozdzielczości będą µ-slides ze szklanym dnem (#1.5H, 170 µm +/-5 µm).

Zostałem zaznajomiony z produktami ibidi µ-slides na początku projektu mojej pracy doktorskiej i od tego momentu stosuję je do moich wszystkich eksperymentów z wykorzystaniem barwień immunofluorescencyjnych. Polecam je wypróbować, jeśli jeszcze nigdy wcześniej nie miałeś okazji ich stosować!

Dowiedz się więcej o komorach oraz szkiełkach do obrazowania firmy ibidi klikając w link tutaj.

Oryginalny tekst artykułu znajdziesz na stronie ibidi.

Shuntaro jest doktorantem nauk biomedycznych w Centre for Translational Oral Research, gdzie pracuje w Grupie Inżynierii Tkankowej na Uniwersytecie w Bergen.

Jego zainteresowania naukowe obejmują mechaniczną regulację procesów komórek macierzystych, które są wykorzystywane w celu regeneracji tkanki kostnej. Shuntaro posiada doświadczenie w zakresie barwienia immunofluorescencyjnego oraz obrazowania komórek, a także tkanek zarodkowych.

Dowiedz się więcej o Shuntaro z jego Instragrama: @stemcell_art

REFERENCJE

• Yamada S, Lav R, Li J, Tucker AS, Green JBA. Molar Bud-to-Cap Transition Is Proliferation Independent. J Dent Res. 2019 Oct;98(11):1253-1261. doi: 10.1177/0022034519869307. Epub 2019 Aug 8. PMID: 31393749; PMCID: PMC6761786.
• Eldred WD, Zucker C, Karten HJ, Yazulla S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 1983 Feb;31(2):285-92. doi: 10.1177/31.2.6339606. PMID: 6339606.